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                    液滴微流控技術在微生物研究中的應用上

                    微生物分類復雜,種類繁多,形態特征多樣并且具有很強的突變能力,除此之外,大多數微生物在目前都是無法人為培養的。因此,亟須利用新的技術手段去分離、培養、篩選、鑒定與分析微生物群落。液滴微流控技術是微流控技術的主要分支,是指對極小體積液流(10-9~10-15 L)進行精確控制的技術,這一技術的出現為解決很多生物學問題提供了新的方法。

                    液滴微流控技術用于微生物研究有以下幾個特點:①將微生物封裝在液滴中,使得少量甚至單個細胞處于隔離的環境中,消除了生長速率差異和種間競爭的影響,有利于研究復雜樣本中的稀有和生長緩慢的微生物,液滴中代謝物的快速積累有助于激活例如群體感應等濃度依賴的生理通路。②微流控裝置能以高達20000 Hz的頻率產生高度均一的液滴并且進行高通量分析,使得超高通量的鑒定、篩選微生物成為了可能。③在液滴微流控系統中,可根據研究目的定制設計通道和集成多種控制模塊以實現液滴的精確操控,包括注入、混合、分散,長時間孵育及分選等操作,因此可以快速且精確的向微生物細胞中引入多種檢測試劑和刺激因素,制造出多樣且可控的環境,以達到高通量且精確的操控微生物細胞的目的。

                    微生物的液滴微流控技術主要由以下幾個部分組成:①液滴生成,包括生成單相分散的液滴、液滴陣列和由不同材料構成的液滴表面或液滴內組分;②操控液滴和液滴內的組分;③對液滴內微生物進行分析。將液滴微流控技術與前沿的測序、動態熒光成像等技術以及新的生物信息學分析方法相結合,會極大地幫助我們進一步了解和研究微生物的世界。本文將對近年來液滴微流控技術在微生物研究的多個方面的應用進行介紹和討論,以期為微生物和微流控技術的研究者們提供一定的參考。

                    1.   微生物的高通量單細胞培養和分離

                    傳統的微生物培養方法不僅培養耗時長且需要較復雜的操作,而且由于細菌的種間抑制作用以及有些微生物的生長速度緩慢甚至無法生長導致一部分微生物的信息被忽略?;谝旱挝⒘骺氐奈⑸锱囵B技術能夠通過把一小群甚至單個微生物置于液滴中培養,避免了種間競爭的影響,達到精確的控制微生物的生長環境以及分離傳統方法不能培養的微生物的目的。

                    MARTIN等第一次使用單相分散的液滴用于高通量的微生物培養,證實微液滴均適用于從單細胞到非常高密度的細胞培養。接著,很多基于液滴培養的新技術先后被報道,如用體積低至10-12 L超微小液滴用于細菌群體感應研究,發現一個單細胞也能啟動群體感應中的高密度行為。微生物在獨立液體中的生長狀態可以通過在明場下記錄細胞的數量或基于熒光強度隨時間的變化強度來進行動態監測。與可視化的檢測技術相比,分子技術,比如定量PCR和基因測序能更加系統性地研究液滴中微生物的生長。VILLA等開發出MicDrop平臺用于在微液滴中分離和培養人腸道微生物,結合DNA測序和16S rRNA定量技術檢測腸道微生物中菌種的絕對水平。使用這一技術也可對糞便樣本中各類腸道微生物的碳水化合物利用水平進行測定。

                    基于液滴微流控技術的微生物培養使得從復雜的微生物群落中分離稀有或難培養的微生物變得更加便捷。JIANG等[20]利用微流控平板劃線(microfluidic streak plate, MSP)進行高通量的單微生物分離和培養,微流控裝置產生的液滴在預先填充載體油的培養皿上劃線,形成固著的液滴陣列。

                    相比于傳統的瓊脂平板劃線,微流控平板劃線具有以下優點:①更高的培養通量及更低的試劑和樣本消耗;②消除了種間競爭和生長速率差異的影響;③載體油上的液滴支持長達5個月的單細胞培養;④允許培養過程中用顯微鏡觀察;⑤培養后,可以使用下一代測序技術進行微生物群落分析以及擴大培養;⑥MSP使用液體培養基避免了瓊脂凝固過程中產生的過氧化氫,利于分離和培養過氧化氫敏感的微生物。 ZHOU等利用MSP平臺從黑胸散白蟻(Reticulitermes chinensis)中分離了幾株潛在的新菌種。CHEN等結合MSP和趨化篩選方法從土壤樣本中分離出了能降解咪唑啉酮的微生物種類。HU等利用MSP平臺支持長期培養的特性,解決了分離稀有海洋微生物的難題。綜上,這些研究證實液體微流控技術可用于高通量培養來自多種環境中的細菌樣本并且能顯著提高分離效率。

                    2.   微生物的高通量檢測、鑒定和微生物組研究

                    微生物檢測和鑒定對微生物基礎研究、食品微生物檢驗和感染性疾病診斷至關重要。由于液滴微流控技術高速和高通量的特性,可作為一個用于高通量和高度平行的微生物分析的理想平臺。近期,多種檢測手段被用于分析微液滴中的微生物,包括各種光學技術、數字PCR和下一代測序技術。

                    2.1   液滴光學檢測技術

                    將熒光原位雜交技術(fluorescence in situ hybridization, FISH)與液滴微流控技術結合可進行高通量的微生物檢測和鑒定。HSIEH等開出發了刃天青增強微陣列檢測(resazurin-amplified picoarray detection, RAPiD)用于簡便精準地對活細菌進行計數。為了避免熒光標簽對細菌正常生理活動的潛在影響,無標記和無創的單細胞拉曼光譜技術(single-cell Raman spectrum, SCRS)被應用于微液滴中的微生物檢測,它是一種基于分子振動信號的代謝物檢測技術,可提供單個細胞內源性的生化“指紋”。結合SCRS與基因組測序技術,可系統性地研究單個細胞的基因組與代謝組,WANG等利用且改進了這一技術系統,并發現了酵母中以前從未被鑒定到的兩個二酰甘油?;D移酶變體。

                    2.2   液滴數字PCR

                    液滴微流控技術的出現進一步革新了數字PCR技術,并直接催生了液滴數字PCR(droplet digital PCR, ddPCR),在ddPCR中,DNA分子被隨機送入每個小液滴中并進行常規的PCR,由于反應混合物中含熒光探針,根據熒光強度可計算出原始樣本中目標DNA的拷貝數,因此ddPCR可用于對樣本中的目的微生物進行檢測并定量。ddPCR與測序技術結合可用于測定復雜群落中的單個微生物類群的絕對豐度,如用于測定小鼠腸腔和黏膜樣本中各細菌種類豐度受飲食的影響。ddPCR在診斷早期病毒感染中也有著優勢。DONG等將ddPCR用于禽類腺病毒的快速檢測,ddPCR的敏感性比傳統的PCR檢測方法高1000倍。后來的研究者對ddPCR進行進一步改進,并用于定量檢測BK病毒、乙肝病毒、人類乳頭瘤病毒等。將ddPCR改進并用于新冠病毒SARS-CoV-2檢測,顯著減少了由于咽拭子樣本中病毒載量少造成的假陰性率并提高了效率。

                    2.3   液滴測序技術用于微生物組研究

                    將液滴微流控與下一代測序技術結合能避免傳統的16S rRNA測序和宏基因組測序導致的單細胞水平上的異質性以及空間微生物組信息的丟失。液滴微流控技術與16S rRNA測序以及宏基因組測序技術的結合產生了MaPS-seq(metagenomic plot sampling by sequencing)技術,該技術是研究復雜生境中微生物空間分布的一種很有前景的技術,它已被用于研究小鼠腸道不同區域的微生物組,揭示了特定種群間的各種分布關系。SHI等整合微生物富集微流控裝置和基于液滴的MDA(multiple displacement amplification)技術用于制備痰液中呼吸道微生物組的DNA用于宏基因組測序,與直接測序相比,該方法在菌株水平上呈現出更大的微生物群落復雜性和更多的基因組信息,并且對識別原噬菌體和DNA病毒具有更高的敏感性。近期,基于液滴微流控技術的微生物高通量單細胞基因組學技術——Microbe-seq被開發了出來,它可獲取大量單一微生物細胞的基因組信息,并將微生物群落的基因組信息精確到菌株水平。利用該方法從一個健康個體的腸道微生物系統中獲取了21914個單一微生物的基因組信息,從中組裝出76個菌種的基因組序列,其中有10個菌種包含不同的菌株。利用這些菌株水平的基因組研究微生物相互作用,構建了在該人體腸道微生物群落中的水平基因轉移網絡并且發現92組菌種之間的水平基因轉移。

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